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Sep 14, 2023

Analyse kritischer Proteine

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 350 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In den letzten Jahren ist das Auftreten des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) als Ursache der globalen Pandemie der Coronavirus-Krankheit (COVID-19) und seiner Varianten, insbesondere solcher mit höherer Übertragbarkeit und erheblicher Immunumgehung, zu verzeichnen. haben die Notwendigkeit hervorgehoben, neuartige Therapeutika als nachhaltige Lösungen neben der Impfung zur Bekämpfung von Coronaviren (CoVs) zu entwickeln. Neben der Rezeptorerkennung und dem Viruseintritt sind Mitglieder des SARS-CoV-2-Replikations-/Transkriptionskomplexes vielversprechende Ziele für die Entwicklung antiviraler Medikamente. Hier wurden die interagierenden Reste, die Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) von nsp10 mit nsp16 und nsp14 vermitteln, umfassend analysiert und die Interaktionskarten, Interaktionsenergien, strukturellen Netzwerke und Dynamiken der Schlüsselreste untersucht. Nsp10 stimuliert sowohl die Exoribonuklease (ExoN) von nsp14 als auch die 2'O-Methyltransferase (2'O-MTase) von nsp16. Nsp14 ExoN ist ein RNA-Korrekturleseenzym, das die Replikationstreue unterstützt. Nsp16 2'O-MTase ist für den Abschluss der RNA-Verkappung verantwortlich, um eine effiziente Replikation und Translation sowie die Flucht aus dem angeborenen Immunsystem der Wirtszelle sicherzustellen. Die Ergebnisse der PPI-Analyse lieferten wichtige Informationen mit Auswirkungen auf die Entwicklung antiviraler SARS-CoV-2-Medikamente. Basierend auf den vorhergesagten gemeinsamen Protein-Protein-Schnittstellen der nsp16-nsp10- und nsp14-nsp10-Wechselwirkungen wurde eine Reihe von Dual-Target-Peptidinhibitoren entwickelt. Die entworfenen Peptide wurden durch molekulares Docking, Peptid-Protein-Wechselwirkungsanalyse und Berechnungen der freien Energie bewertet und anschließend durch In-silico-Sättigungsmutagenese weiter optimiert. Basierend auf der vorhergesagten evolutionären Konservierung der interagierten Zielreste zwischen CoVs haben die entworfenen Peptide das Potenzial, als Dual-Target-Pan-Coronavirus-Inhibitoren entwickelt zu werden.

Die neuartige menschliche Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) als Folge der Infektion mit dem schweren akuten respiratorischen Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1 hat weltweit eine große Anzahl bestätigter Todesfälle und eine globale Wirtschaftskrise verursacht den letzten Jahren. SARS-CoV-2 ist ein umhülltes kugelförmiges Betacoronavirus, das zur RNA-Virusfamilie Coronaviridae2 gehört. Das SARS-CoV-2-Genom weist eine Sequenzidentität von 96,2 %, 79 % bzw. 50 % mit dem Fledermaus-Coronavirus, dem schweren akuten respiratorischen Syndrom-Coronavirus (SARS-CoV) bzw. dem Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus (MERS-CoV) auf. Das Auftreten von SARS-CoV-2 und dann seiner Varianten, insbesondere der besorgniserregenden Varianten (VOCs), zusammen mit den früheren Notfällen von SARS-CoV in den Jahren 2002–2003 mit 8096 Fällen und 774 Todesfällen (~ 10 % Sterblichkeitsrate) und MERS -CoV im Jahr 2012 mit 1728 bestätigten Fällen und 624 Todesfällen (~ 36 % Sterblichkeitsrate)3 bewies, dass Coronaviren (CoVs) seit langem eine große Bedrohung für den Menschen darstellen. Die Pathogenität anderer menschlicher CoVs, die Erkältungen verursachen, sollte ebenfalls berücksichtigt werden, insbesondere bei Säuglingen und Kindern4. Der beschleunigte Eintritt von SARS-CoV-2 in die Wirtszelle, vergleichbar mit anderen CoVs5, und das Aufkommen der Omicron-Variante (B.1.1.529) mit höherer Übertragbarkeit (3,2-mal höher als Delta) und erheblicher Immunumgehung6 sowie deren jüngste Bei neu auftretenden Unterlinien wie BA.4 und BA.5 ist die Wirksamkeit vorhandener Impfstoffe gemindert, was zu erneuten Infektionen und der Umgehung von Impfstoffen führt7. Daher könnten die ersten COVID-19-Impfstoffe und -Therapeutika keine Langzeitlösungen sein. Daher ist es neben der Entwicklung von Diagnose- und Überwachungstechnologien für SARS-CoV-28,9,10 zwingend erforderlich, neuartige Therapeutika zur Bekämpfung von CoVs als nachhaltige Lösungen zu entwickeln.

Die offenen Leserahmen (ORFs) 1a/b sind die größten ORFs im SARS-CoV-2-Genom. Diese ORFs befinden sich am 5′-Ende des Genoms und kodieren zwei sehr große Replikase-Polyprotein-Vorläufer, pp1a und pp1ab, die posttranslational durch virale Proteasen in 16 nichtstrukturelle Proteine ​​(nsps) gespalten werden (Abb. S1). Nsp12, nsp13, nsp16, nsp14, nsp10, nsp7 und nsp8 sind wesentliche Mitglieder des SARS-CoV-2-Replikations- und Transkriptionskomplexes (RTC), der für das Überleben, die Evolution und die Ausbreitung des Virus verantwortlich ist. RTC fördert die RNA-Replikation, Transkription, das Korrekturlesen und das Capping durch komplexe Assemblierung von NSP-NSP- und NSP-Virus-RNA-Interaktionen11,12,13,14.

Ein evolutionär konservierter Co-Transkriptionsprozess im Zellkern aller eukaryotischen Zellen gewährleistet die Modifikation des 5′-Endes entstehender mRNAs mit einer Kappe. Die mRNA-Kappe fungiert als konservierende Molekülgruppe gegen Exonuklease-Spaltung, stabilisiert RNA-Moleküle, gewährleistet einen effizienten nukleozytoplasmatischen Transport, eine kräftige cap-abhängige Proteintranslation und Prä-mRNA-Verarbeitung und verhindert außerdem die Unterscheidung von nicht-eigener RNA bei der angeborenen Immunantwort15,16 . Die Verkappung von RNAs wurde von Viren missbraucht, um die Reaktionen des Immunsystems des Wirts durch verschiedene Mechanismen zu überwinden. Die Coronaviridae-Mitglieder haben ihren eigenen spezifischen Verschlussprozess entwickelt17. Der Capping-Mechanismus von SARS-CoV-2 besteht aus vier Schritten, die von einer Reihe von NSPs ausgeführt werden, darunter NSP13 als RNA-5′-Triphosphatase (RTPase), eine unbekannte Guanylyltransferase (GTase), der C-Terminus von NSP14 für N7-Guanin-Methyltransferase (N7-MTase)-Aktivität und nsp16 und sein kritischer Cofaktor nsp10 für die 2'O-Methyltransferase (2'O-MTase)-Aktivität12,18,19 (Abb. 1b).

Schematische Darstellung des SAR-CoV-2-Replikations- und Transkriptionskomplexes (RTC) und seines mRNA-Capping-Prozesses. (a) Zu den Hauptmitgliedern von SARS-CoV-2 RTC gehören die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp; nsp12), ein multifunktionales Protein mit Helikase- und RNA-5′-Triphosphatase-Aktivitäten (Hel-RTPase; nsp13) und Methyltransferase-Enzyme (MTase; nsp16). und der C-Terminus von nsp14), Exoribonuklease (ExoN; der N-Terminus von nsp14) und nsp10 als entscheidender Aktivator für die Aktivierung von nsp14 ExoN und nsp16 MTase. (b) Die Schritte des SARS-CoV-2-mRNA-Capping-Prozesses: Zunächst wird die Interphosphatbindung am 5'-Ende der entstehenden triphosphorylierten RNA (pppN) durch nsp13 als RTPase hydrolysiert, wodurch das Diphosphat-5'-ppN-Transkriptende entsteht. Zweitens wird Guanosintriphosphat (GTP) durch eine unbekannte Guanylyltransferase (GTase) in Guanosinmonophosphat (GMP) gespalten und auf 5′-Diphosphat-mRNA übertragen, um GpppN zu produzieren. Drittens wird die Cap-0-Struktur (7mGpppN) durch nsp14 N7-Guanin-Methyltransferase (N7-MTase) in Gegenwart von S-Adenosylmethionin (SAM) gebildet. Schließlich wird die Cap-1-Struktur durch den nsp16-nsp10-Komplex mit 2'O-Methyltransferase (2'O-MTase)-Aktivität erzeugt.

Die Untersuchung der RTC-Mitglieder und insbesondere der Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) von NSPs kann ein produktives Mittel zur Entwicklung vielversprechender interferierender Inhibitoren für CoVs sein, insbesondere nach dem Viruseintritt in Wirtszellen. Die entscheidende Rolle von PPIs in fast allen biologischen Prozessen macht sie für therapeutische Ansätze immer attraktiver20. In jüngster Zeit wurden interferierende Peptide (IPs) häufiger anerkannt21, und einige therapeutische Peptide, die auf PPIs abzielen, wurden von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA)22 zugelassen. Mehrere Studien haben die Wirksamkeit abgeleiteter Peptide bei der Hemmung von PPIs bei CoVs23,24,25,26,27 gezeigt. Darüber hinaus deuten klinische Daten und rechnerische Ansätze darauf hin, dass SARS-CoV-2-NSPS-Impfstoffe immundominante Peptide mit der Fähigkeit sind, globale Immunität gegen COVID-1928 zu verleihen.

Wir haben kürzlich das Protein-Protein-Bindungsmuster des SARS-CoV-2-Eintritts untersucht29. Das übergeordnete Ziel der aktuellen Studie bestand darin, die Wechselwirkungen von nsp10 als gemeinsamem Aktivator mit der nsp16-Capping-MTase und dem nsp14-ExoN im SARS-CoV-2-RTC zu beleuchten und anschließend Peptidinhibitoren zu entwickeln, die auf diese kritischen PPIs abzielen (Abb . S2). Zunächst wurden die kritischen wechselwirkenden Reste, die an diesen PPIs beteiligt sind, untersucht und dann unter den Gesichtspunkten der Zersetzung freier Energie, Wechselwirkungskarten und -energien, struktureller Netzwerke und Molekulardynamik analysiert (Abb. S3). Diese umfassenden Analysen liefern ein Gesamtbild der kritischen Rückstände, die für die Vermittlung von Kappungs- und Korrekturlesemechanismen bei SARS-CoV-2 von größter Bedeutung sind. Diese Schlüsselreste dienen als arzneimittelverwertbare Rückstände und haben Auswirkungen auf die Entwicklung von SARS-CoV-2-Arzneimitteln. Als nächstes wurde entsprechend den erhaltenen Ergebnissen ein Satz dualer Ziel-inhibitorischer Peptide entworfen, basierend auf den vorhergesagten gemeinsamen Protein-Protein-Schnittstellen von nsp16-nsp10- und nsp14-nsp10-Wechselwirkungen. Somit eröffnen diese Peptide einen neuen Weg, um gleichzeitig die RNA-Capping- und Korrekturlesemaschinen von SARS-CoV-2 zu stören, mit dem Potenzial, das Entweichen von Viren aus der Immunerkennung des Wirts zu hemmen, die Mutationsrate zu erhöhen und folglich zu tödlichen Auswirkungen auf SARS-CoV-2 zu führen. CoV-2. Die vorhergesagte evolutionäre Konservierung der Zielreste, die mit den entworfenen Peptiden interagierten, über das breite Spektrum von CoVs hinweg weist auf die große Wirksamkeit der entworfenen Peptide hin, die als neue Pan-Coronavirus-Antivirenmittel für aktuelle oder zukünftige mögliche Ausbrüche im Zusammenhang mit CoVs entwickelt werden sollen.

Die Proteindatenbank (rcsb.org/)30 wurde verwendet, um die nsp16-nsp10-Komplexstrukturen von SARS-CoV-2 (PDB-ID 6W75)31, SARS-CoV (PDB-ID 2XYQ)32 und MERS-CoV (PDB-ID) zu erhalten 5YNB) und HCoV-OC43 (PDB-ID 7NH7)33. Die Struktur des SARS-CoV-2-nsp14-nsp10-Komplexes wurde modelliert, indem der SARS-CoV-nsp14-nsp10-Komplex (PDB-ID 5C8S)14 als Vorlage mit SWISS-MODEL34 ausgewählt wurde.

Die Reste an den Grenzflächen der untersuchten Protein-Protein-Komplexe wurden mithilfe von drei In-silico-Tools vorhergesagt, darunter PPCheck 35, PISA-Dienst (Protein Interfaces, Surfaces and Assemblies) am Europäischen Bioinformatik-Institut (http://www.ebi.ac). .uk/pdbe/prot_int/pistart.html)36 und ISPRED437. Als nächstes wurden die Hotspot-Reste mithilfe von KFC2 (Knowledge-based FADE and Contacts)38, DrugScorePPI39 und Robetta40 vorhergesagt. Um die Genauigkeit der Ergebnisse zu verbessern, wurde eine Kombination von Werkzeugen verwendet, um Protein-Protein-Grenzflächen und Hotspots zu identifizieren. Ein Rückstand wurde als Schlüsselrückstand (Schnittstelle und/oder Hotspot) betrachtet, wenn er mindestens in den Ergebnissen von zwei der drei Tools vorhanden war. Darüber hinaus wurden für eine vergleichende Analyse auch die PPI-Schnittstelle und Hotspot-Reste des nsp16-nsp10-Komplexes von SARS-CoV, MERS-CoV und HCoV-OC43 auf der Grundlage des obigen Ansatzes vorhergesagt. Die Schlüsselreste wurden von UCSF Chimera41 den Strukturen von Proteinen zugeordnet. Das Sekundärstrukturdiagramm für beide Komplexe wurde mit PDBsum42 vorhergesagt. Als nächstes wurde mit dem mCSM-PPI2 (http://biosig.unimelb.edu.au/mcsm_ppi2) ein rechnergestütztes Alanin-Scanning (CAS) der vorhergesagten wichtigsten interagierenden Reste der SARS-CoV-2 nsp16-nsp10- und nsp14-nsp10-Komplexe durchgeführt /) und die Auswirkung jeder Mutation wurde durch Vorhersage des Unterschieds in den Protein-Protein-Bindungsaffinitäten zwischen dem Wildtyp und der Mutante bewertet, der als ΔΔGAffinität (ΔΔG = ΔGMutant − ΔGwildtyp)43 definiert ist. Außerdem wurden die Wechselwirkungen zwischen den Wildtyp- und mutierten Resten mit der negativsten ΔΔGA-Affinität und ihren nahegelegenen Resten analysiert. Anschließend wurde vom HawkDock-Server (cadd.zju.edu.cn/hawkdock)44 eine Zersetzungsanalyse der freien Energie pro Rest durch MM-GBSA-Berechnungen (Molecular Mechanics-Generalized Born Surface Area) für SARS-CoV-2 nsp16 durchgeführt. nsp10- und nsp14-nsp10-Komplexe.

Die Wechselwirkungen der Rückstände wurden mithilfe von DIMPLOT von Ligplot+45 analysiert und in 2D-Karten dargestellt. Außerdem wurde der Protein Interactions Calculator (PIC)-Server (pic.mbu.iisc.ernet.in)46 zur Analyse verschiedener Arten von Interaktionen verwendet. Darüber hinaus wurde COCOMAPS (molnac.unisa.it/BioTools/cocomaps)47 verwendet, um die untersuchten PPI-Schnittstellen bei einem Grenzabstand von 8 Å zu analysieren, indem die Abstands- und Eigenschaftskontaktkarten bereitgestellt wurden. Darüber hinaus wurden die zugänglichen Oberflächen der Komplexe von COCOMAPS vorhergesagt. Darüber hinaus wurden die Wechselwirkungsenergien (IEs) zwischen Resten vom Webserver Amino Acid Interactions (INTAA) (bioinfo.uochb.cas.cz/INTAA/)48 mit Hilfe des wasserähnlichen Kraftfeldes AMBER parm99 (OBC) vorhergesagt -II) Umgebung und der Modus zum Hinzufügen von Wasserstoff. Heatmaps wurden mit THE Heatmapper49 erstellt. Das gesamte Verfahren wurde sowohl für die SARS-CoV-2-nsp16-nsp10- als auch die nsp14-nsp10-Komplexe durchgeführt.

Der Network Analysis of Protein Structures (NAPS)-Server (bioinf.iiit.ac.in/NAPS/index.php)50 wurde für die strukturelle Netzwerkanalyse der SARS-CoV-2-Komplexe nsp16-nsp10 und nsp14-nsp10 verwendet. Die Knotenzentralitätsparameter, einschließlich Gradzentralität (DC), Zwischenzentralität (BC) und Nähezentralität (CC) der Reste im Netzwerk, wurden durch Auswahl des ungewichteten C-Alpha-Netzwerktyps mit einem oberen Schwellenwert von 7 Å vorhergesagt Proteinkomplexmodus von NAPS.

Molekulardynamiksimulationen (MD) von nsp14-nsp10-, nsp16-nsp10-Komplexen sowie nsp14-, nsp16- und nsp10-Proteinen wurden mit dem AMBER14-Paket51 unter Verwendung des ff14SB-Kraftfeldes52 durchgeführt. Die Systeme wurden durch das explizite Wasser-TIP3P-Modell in einem oktaedrischen Kegelstumpf bei einer Hydratationsschicht von 12 Å unter Verwendung von xleap solvatisiert. Zur Neutralisierung der Systeme wurden fünf Chloridionen zugesetzt. Alle kovalenten Bindungen für die Wasserstoffatome wurden mithilfe des SHAKE-Algorithmus53 zu den Systemen hinzugefügt. Die elektrostatischen Wechselwirkungen wurden mit dem PME-Algorithmus (Particle Mesh Ewald)54 mit einem Schwellenwert von 10 Å für die Lennard-Jones-Potentialwechselwirkungen unter periodischen Randbedingungen berechnet. Der Minimierungsschritt wurde durchgeführt, um Hochenergiekontakte zu entfernen, wobei 2000 Schritte der Methode des steilsten Abstiegs bzw. 3000 Schritte der konjugierten Gradientenmethode verwendet wurden. Anschließend wurde jedes System über 400 ps in einem konstanten Volumen vollständig von 0 auf 300 K erhitzt. Das Gleichgewicht der Systeme wurde unter konstanten Druck- und Temperaturbedingungen für 1 ns durchgeführt. Nach der Äquilibrierung wurden die Simulationen mit pmemd über einen Zeitraum von 100 ns durchgeführt. Der Langevin-Algorithmus55 wurde verwendet, um die Temperatur innerhalb der Simulationen zu steuern. Abschließend wurden die Trajektorien mit cpptraj56 analysiert. XMGRACE57 wurde verwendet, um Diagramme der quadratischen Mittelabweichung (RMSD) und der quadratischen Fluktuation (RMSF) zu erstellen.

In dieser Studie wurden die inhibitorischen Peptide auf der Grundlage zweier Methoden entwickelt. Im ersten Ansatz wurden die inhibitorischen Peptide manuell auf der Grundlage der vorhergesagten überlappenden interagierenden Reste von nsp10 entworfen, die sowohl mit nsp16 als auch mit nsp14 in SARS-CoV-2 interagieren. Im zweiten Ansatz wurden PPIs an den Schnittstellen der SARS-CoV-2-Komplexe nsp16-nsp10 und nsp14-nsp10 einzeln mit dem Peptiderive58-Server analysiert, um Peptidinhibitoren zu entwickeln, die auf nsp16/nsp14 abzielen. Peptiderive trennte systematisch Peptide von nsp10 mit einem Schiebefenster (mit 5–15 Längen in jeder Vorhersagephase) und bewertete dann die Beiträge dieser isolierten Peptide zur Gesamtinteraktion.

Im ersten Schritt wurde das molekulare Andocken mithilfe des HPEPDOCK-Servers (http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/)59 durchgeführt, um die entworfenen Peptide lokal an ihre jeweiligen Ziele anzudocken. Die Bindungsstellenreste des Ziels wurden als Referenz basierend auf den vorhergesagten Schlüsselinteraktionsresten des Ziels angegeben. Die besten Modellauswahlkriterien aus den Top 10 der vorhergesagten Modelle für jeden Peptid-Zielkomplex waren wie folgt: (i) das Modell, das an die Schlüsselreste des Ziels mit einer ähnlichen Pose relativ zur Referenzinteraktion gebunden war und mit mehr Schlüsselresten interagierte des Ziels; (ii) das Modell mit relativ niedrigem RMSD unter allen vorhergesagten Modellen, das durch Überlagerung mit der Referenzstruktur untersucht wurde; und (iii) das Modell mit der niedrigsten Andockenergiebewertung. Jedes Modell des Peptid-Protein-Komplexes wurde mit DIMPLOT45 und UCSF Chimera41 analysiert. Basierend auf den HPEPDOCK-Ergebnissen wurden die besten Peptide einer weiteren Docking-Analyse unterzogen. Anschließend wurden die 3D-Strukturen der ausgewählten Peptide mit MODPEP (http://huanglab.phys.hust.edu.cn/modpep/)60 modelliert. Das beste Modell wurde ausgewählt und diesem Schritt folgte das Peptid-Protein-Docking mit HADDOCK 2.461. Die vorhergesagten wichtigsten interagierenden Reste aus den vorherigen Schritten wurden als aktive Reste spezifiziert, die direkt an der Peptid-Protein-Wechselwirkung beteiligt waren, und alle umgebenden Oberflächenreste innerhalb des 6,5 Å-Radius um die aktiven Reste wurden als passive Reste definiert. Bemerkenswert ist, dass die ExoN-Domäne von nsp14 für das molekulare Andocken verwendet wurde. Hier wurden die gleichen Auswahlkriterien für das beste Modell wie im vorherigen Schritt verwendet. Die freie Bindungsenergie (ΔG) und die Dissoziationskonstante (Kd) des besten Komplexes des entworfenen Peptid-Ziels, der durch den zweiten Schritt des Andockens erhalten wurde, wurden mit Prodigy (wenmr.science.uu.nl/prodigy)62 vorhergesagt. Darüber hinaus wurden MM-GBSA-Berechnungen unter Verwendung des ff02-Kraftfelds, 2000 Zyklen des steilsten Abstiegs und 3000 Zyklen konjugierter Gradientenminimierungen im HawkDock (cadd.zju.edu.cn/hawkDock)44 verwendet, um die freien Bindungsenergien des Peptids zu berechnen –Proteinkomplexe und zerlegen sie in Beiträge pro Rest.

Die MM-PBSA63-Methode wurde verwendet, um die freie Bindungsenergie (ΔGbinding) der am besten bewerteten Peptide an ihre jeweiligen Ziele abzuschätzen. Für 50 ns wurden MD-Simulationen der Peptid-Protein-Komplexe mit der besten Bewertung mit AMBER1451 durchgeführt. Anschließend wurden 200 Schnappschüsse von Peptid-Protein-Komplexen in verschiedenen Zeitschritten von der Flugbahn aufgenommen, um die Durchschnittswerte der ΔG-Bindung durch mmpbsa.py64 zu berechnen.

Die entworfenen Peptide mit der besten Bewertung wurden mithilfe einer In-silico-Sättigungsmutageneseanalyse optimiert, indem jeder Rest der entworfenen Peptide als Leitsequenzen für die anderen 19 Aminosäuren mutiert wurde, um eine neue Peptidbibliothek zu erzeugen. Anschließend wurden die Änderung der Bindungsaffinität des neuen mutierten Peptid-Zielkomplexes im Verhältnis zum Leitpeptid-Zielkomplex (ΔΔGAffinität) und der Einfluss jeder Mutation auf die Peptid-Ziel-Bindungsaffinität mithilfe von mCSM-PPI243 vorhergesagt. Um die entworfenen Peptide weiter zu bewerten, wurden ihre allgemeinen Eigenschaften, einschließlich Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt und Nettoladung bei pH 7, mit Pep-CaLc65 berechnet. Auch die pharmakokinetischen Eigenschaften der entworfenen Peptide wurden von pkCSM (http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/) vorhergesagt66. Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) der entworfenen Peptide wurde vom AVP-IC50Pred (crdd.osdd.net/servers/ic50avp/) unter Verwendung der Random Forest (RFs)-Maschinenlerntechnik vorhergesagt67. Die Allergenität und Toxizität der Peptide wurden von AllergenFP v.1.068 bzw. ToxinPred69 vorhergesagt. Die Zielprotein-Peptid-Komplexe wurden mit CABS-flex 2.0 (biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSflex2/index)70 mit Standardparametern simuliert, um die Schwankungen der Rückstände zu analysieren und die RMSF-Diagramme zu erstellen.

Es wurden mehrere Sequenz-Alignments von nsp10-, nsp16- und nsp14-Sequenzen von sieben menschlichen CoVs durchgeführt, darunter SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63 und HCoV-229E mit MultAlin71. Zum Rendern der Sequenzen wurde ESPrip verwendet72. Um die evolutionär konservierten Reste der nsp10- und nsp16-Proteine ​​in allen gemeldeten Strukturen des nsp16-nsp10-Komplexes, einschließlich SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV und HCoV-OC43, zu untersuchen, wurde der ConSurf-Webserver (consurf .tau.ac.il/)73 wurde basierend auf der Bayes'schen Methode eingesetzt. Darüber hinaus wurde die Aminosäurekonservierung des SARS-CoV-2-nsp14-Proteinmodells analysiert.

In dieser Studie wurden zunächst die Schlüsselreste an der Schnittstelle von Protein-Protein-Komplexen vorhergesagt, die PPIs vermitteln. Eine Darstellung des Arbeitsablaufs dieser Studie ist in Abb. S3 dargestellt. Die endgültigen vorhergesagten Protein-Protein-Schnittstellen- und Hotspot-Reste der SARS-CoV-2-Komplexe nsp16-nsp10 und nsp14-nsp10 sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die wichtigsten interagierenden Reste, die mit jedem Tool vorhergesagt wurden, sind in Tabelle S1 aufgeführt. Für den nsp16-nsp10-Komplex wurden 33 Reste als Nsp16-Grenzflächenreste und 26 Reste als Nsp10-Grenzflächenreste vorhergesagt. V42, K43, M44, L45 und Y96 von nsp10 sowie I40, M41, V44, T48, V78, V84, Q87, V104 und D106 von nsp16 wurden als Hotspot-Reste für den nsp16-nsp10-Komplex vorhergesagt. Für den nsp14-nsp10-Komplex wurden 106 Reste an der Protein-Protein-Grenzfläche identifiziert, 45 bzw. 61 Reste an den Schnittstellen von nsp14 und nsp10. T5, E6, N10, S11, L14, S15, F16, F19, V21, N40, V42, M44, S72, R78, C79, H80, F89, K93 und Y96 wurden als nsp10-Hotspots im nsp14-nsp10-Komplex vorhergesagt . Die wichtigsten interagierenden Reste beider Komplexe wurden ihren Strukturen zugeordnet (Abb. 2a, b). Außerdem sind die Sekundärstrukturdiagramme für die SARS-CoV-2-Komplexe nsp16-nsp10 und nsp14-nsp10 in den Abbildungen S4 bzw. S5 dargestellt.

Analyse der SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 und nsp14-nsp10 Protein-Protein-Schnittstellen und Hotspot-Reste. (a) Die Schnittstellen und Hotspots wurden der nsp16-nsp10-Struktur an den Protein-Protein-Grenzflächen von nsp16 (grau) und nsp10 (cyan) zugeordnet, die orange bzw. rot gefärbt sind. (b) Die Grenzflächen und Hotspots an den Protein-Protein-Grenzflächen von nsp14 (Magenta) und nsp10 (Cyan) sind gelb bzw. rot gefärbt. Hotspot-Rückstände werden in roten Etiketten angezeigt. (c) Die überlappenden Schlüsselschnittstellen- (lila) und Hotspot-Reste (rot) von nsp10 (cyan), die sowohl mit den Proteinen nsp16 als auch nsp14 interagierten.

Bemerkenswert ist, dass unter den wichtigsten interagierenden Resten von nsp10 24 Schnittstellenreste und drei Hotspot-Reste zwischen den beiden Komplexen in SAR-CoV-2 geteilt wurden. Diese Schlüsselreste von nsp10 interagierten sowohl mit nsp16 (2′O-MTase-Capping) als auch mit nsp14 (ExoN-Korrekturlesen). Die überlappenden gemeinsamen Schnittstellenreste von nsp10 in diesen beiden Komplexen waren T39, N40, C41, V42, K43, M44, L45, C46, ​​T47, V57, T58, P59, G69, G70, A71, S72, C77, R78, C79, H80, K93, G94, K95 und Y96. Häufige Hotspots waren V42, M44 und Y96 (Abb. 2c). Darüber hinaus zeigte die Analyse der PPI-Grenzflächen- und Hotspot-Reste die Wechselwirkungen zwischen den Resten in der N-terminalen Schleife und der H1-Helix der nsp10- und nsp14-ExoN-Domäne. Um die Ähnlichkeiten und Unterschiede in den Wechselwirkungen von nsp10 mit nsp16 zwischen CoVs aufzuklären, wurden außerdem die Protein-Protein-Schnittstellen und Hotspots des nsp16-nsp10-Komplexes in SARS-CoV, MERS-CoV und HCoV-OC43 durch Anwendung des vorhergesagt derselbe Ansatz (Tabelle S1). Rückstände, darunter V42, K43, M44 und L45, waren in all diesen CoVs häufige Hotspots von nsp10. Die Unterschiede lagen bei T47, R78 und Y96 von nsp10 bei SARS-CoV; K58, H80 und F96 von nsp10 in MERS-CoV; und N40, C41, C46, ​​D47, V57, K58, S72, C77, R78, H80, L89, C90, R93, K95 und F96 von nsp10 in HCoV-OC43. V84, Q87, V104 und D106 waren die gemeinsamen Hotspots von nsp16 unter diesen CoVs (Abb. S6–S8).

Als nächstes wurden die vorhergesagten Schlüsselwechselwirkungsreste durch CAS unter Verwendung von mCSM-PPI2 analysiert. Insgesamt wurden 153 Mutationen analysiert, um den Einfluss der Alaninsubstitution auf die Affinität der Protein-Protein-Bindung vorherzusagen (Tabelle S2). Wie in Abb. S9 gezeigt, umfassen die Mutationen Y96A, L45A, V42A, M44A und G70A von nsp10; V84A, D106A, V44A, I40A und R86A von nsp16 im nsp16-nsp10-Komplex; F16A, Y96A, H80A, E6A und F19A von nsp10 und F8A, P24A, F60A, Q22A und D10A von nsp14 im nsp14-nsp10-Komplex; zeigte die negativste ΔΔGAffinität mit den größten abnehmenden Auswirkungen auf die Bindungsaffinitäten nsp16-nsp10 und nsp14-nsp10. Diese Ergebnisse zeigten die entscheidende Rolle dieser Reste bei der Vermittlung von PPIs. Alle diese Reste mit Ausnahme von G70 von nsp10, R86 von nsp16 und P24 von nsp14 wurden im vorherigen Schritt als Hotspots vorhergesagt. Es gibt jedoch Mutationen, einschließlich T49A, V57A und C79A von nsp10 sowie T91A, G92A und S248A von nsp16 im nsp16-nsp10-Komplex, P8A, S33A, V57A und C79A von nsp10 sowie T21A, C39A und K47A von nsp14 im nsp14-nsp10-Komplex zeigten kleine positive ΔΔGAffinitätswerte (< 1,3 kcal/mol), was auf die geringste Bedeutung solcher Reste für die Komplexbildung hinweist. Die Wechselwirkungen zwischen den Wildtyp- und Mutantenresten mit der negativsten ΔΔGA-Affinität und ihren nahegelegenen Resten sind in den Abbildungen dargestellt. S10–S13. Darüber hinaus sind die Ergebnisse der Analyse der freien Energie pro Rest unter Verwendung der MM-GBSA-Methode für die Komplexe nsp16-nsp10 und nsp14-nsp10 in Tabelle S3 aufgeführt. Diese Ergebnisse zeigten, dass die wichtigsten interagierenden Reste im Vergleich zu anderen Resten erheblich zur Bindung der freien Energie durch die PPIs beitrugen. Die niedrigsten geschätzten freien Bindungsenergien von L45, V42 und M44 von nsp10 und Q87, I40 und V104 von nsp16 im nsp16-nsp10-Komplex; und F19, V21 und H80 von nsp10 sowie N130, H26 und I201 von nsp14 im nsp14-nsp10-Komplex zeigten jeweils ihre größten Beiträge in diesen beiden PPIs. Die MM-GBSA-Ergebnisse stimmten mit der Hotspot-Vorhersage und den CAS-Ergebnissen überein; Allerdings wurde der N130 von nsp14 im vorherigen Schritt nicht als Hotspot vorhergesagt.

Laut Analyse der 2D-Karten der Rest-Rest-Wechselwirkungen im SARS-CoV-2-nsp16-nsp10-Komplex waren die hydrophoben Wechselwirkungen die häufigsten Wechselwirkungen (Abb. S14a). N40, V42, K43, M44, L45, P59, A71, K93 und Y96 von nsp10 trugen zu mehreren hydrophoben Wechselwirkungen mit den nsp16-Resten bei. Darüber hinaus bildeten K43, L45, A71, K93, G94 und Y96 von nsp10 H-Bindungen mit den Resten von nsp16. A71 und G94 von nsp10 waren an H-Brücken mit D106 von nsp16 beteiligt. Darüber hinaus bildeten K43, L45, K93 und Y96 von nsp10 H-Bindungen mit K38, Q87, S105 bzw. A83 von nsp16. Die Analyse der nsp16-nsp10-Wechselwirkung durch PIC lieferte die gleichen Ergebnisse wie DIMPLOT (Tabelle S4), was darauf hinweist, dass die hydrophoben Wechselwirkungen vorherrschend waren. Darüber hinaus zeigte die PIC-Analyse, dass E66 und H80 von nsp10 ionische Wechselwirkungen mit K38 bzw. D102 von nsp16 bildeten. Um eine vergleichende Analyse durchzuführen, wurden außerdem 2D-Kartendiagramme der Restwechselwirkungen für den nsp16-nsp10-Komplex in anderen CoVs (SARS-CoV, MERS-CoV und HCoV-OC43) erstellt. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen dargestellt. S15–S17.

Gemäß den DIMPLOT-Ergebnissen für den SARS-CoV-2-nsp14-nsp10-Komplex (Abb. S14b) waren die Wechselwirkungen der Reste an den Protein-Protein-Grenzflächen überwiegend hydrophob, ähnlich wie es für den nsp16-nsp10-Komplex beobachtet wurde. Die H-Brückenanalyse ergab, dass K43 und L45 von nsp10 H-Brücken mit dem C39 von nsp14 bildeten. Weitere H-Brücken wurden zwischen T5, E6 und S15 von nsp10 bzw. S28, T5 und F60 von nsp14 gefunden. K93 von nsp10 trug über zwei H-Bindungen zu den Wechselwirkungen mit D126 und T127 von nsp14 bei. Außerdem wurden H-Bindungen zwischen N40, G94 und Y96 von nsp10 bzw. H29, K47 und D41 von nsp14 gebildet. Ebenso lagen die Ergebnisse von DIMPLOT und PIC für den nsp14-nsp10-Komplex in derselben Linie. Darüber hinaus wurden von PIC für den nsp14-nsp10-Komplex andere verschiedene Arten von Wechselwirkungen vorhergesagt, z. B. ionische, aromatisch-schwefelige, aromatisch-aromatische und Kation-pi-Wechselwirkungen (Tabelle S4). Die Unterschiede in den Wechselwirkungen von SARS-CoV-2 nsp10 mit nsp16 und nsp14 lagen hauptsächlich in den Wechselwirkungen von Resten am N-Terminus von nsp10 mit nsp14, den Wechselwirkungen wie H-Brücken zwischen A1, A18, F19, V21 und D29 von nsp10 bzw. K9, K196, I201, I201 und Y69 von nsp14. Darüber hinaus bildete N3 von nsp10 zwei H-Brücken mit D10 von nsp14.

Die intermolekularen Kontakte mit einem Grenzabstand von 8 Å wurden mit COCOMAPS analysiert, um die nsp16/nsp14-Regionen darzustellen, die mit dem SARS-CoV-2 nsp10 in Kontakt stehen. In den Abstandsbereich-Kontaktkarten (Abb. S18a) sind die intermolekularen Kontakte beider Komplexe entsprechend zunehmendem Abstand eingefärbt. Restpaare von nsp10 und nsp16, einschließlich Y96-A83, K43-K38, K93-S105, L45-Q87 und G94-D106, wiesen einen Mindestabstand von < 2,82 Å auf. Darüber hinaus wurden die Restpaare einschließlich F60-S15, K9-A1 und Y69-D29 von nsp14 und nsp10 im nsp14-nsp10-Komplex mit einem Mindestabstand von < 2,64 Å beobachtet. Die Kontaktkarte des nsp14-nsp10-Komplexes könnte auf die Rolle der mit nsp10 interagierenden Reste bei der Aktivierung des nsp14-ExoN am N-Terminus hinweisen. Es wurde kein intermolekularer Kontakt zwischen nsp10 und dem C-Terminus von nsp14 beobachtet. Die physikalisch-chemische Natur der Wechselwirkungen wird durch die Eigenschaftskontaktkarten angezeigt (Abb. S18b). Wie aus den Eigenschaftskarten hervorgeht, trugen die hydrophoben Wechselwirkungen für beide Komplexe mehr bei als die hydrophilen Wechselwirkungen. Diese Ergebnisse stimmten gut mit den DIMPLOT- und PIC-Ergebnissen überein. Darüber hinaus zeigte COCOMAPS, dass bei der Bildung des SARS-CoV-2-nsp16-nsp10-Komplexes eine große Fläche von etwa 1852,3 Å2 vergraben wurde und seine große Grenzflächenfläche etwa 926,75 Å2 betrug. In ähnlicher Weise waren sowohl die vergrabene Fläche als auch die Grenzflächenfläche des SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 bei der Komplexbildung groß und maßen 4358,47 bzw. 2180,15 Å2.

Als nächstes wurden die Rest-Rest-Wechselwirkungsenergien (IEs) der SARS-CoV-2-Komplexe nsp16-nsp10 und nsp14-nsp10 mithilfe von INTAA analysiert. Den Ergebnissen zufolge zeigten D106 von nsp10 und D125 von nsp16 die negativsten Netto-IES (−190,6 bzw. −518,33 kJ/mol). Unter den vorhergesagten wichtigen interagierenden Resten zeigten E66, Y96 und S72 von nsp10 sowie D106, D108 und S105 von nsp16 die negativsten Netto-IEs. Abbildung S19 zeigt eine Wärmekarte für paarweise Rest-Rest-IEs zwischen den vorhergesagten wichtigen interagierenden Resten von nsp10 und nsp16. Zu den negativsten paarweisen IEs mit stabilisierender Rolle bei PPIs gehörten die Wechselwirkungen zwischen K93 und D106, K93 und S105, A71 und D106, G94 und D106 von nsp10 bzw. nsp16. Wie bereits erwähnt, wurden die Abstände des Restpaars, einschließlich K93 und S105 sowie G94 und D106, im vorherigen Schritt von COCOMAPS unter den Mindestabständen vorhergesagt. Die IEs-Analyse des nsp14-nsp10-Komplexes ergab, dass E6 von nsp10 und E284 von nsp14 die negativsten Netto-IES aufwiesen (−504,75 bzw. −296,05 kJ/mol). E6, D29, K25 und D22 von nsp10 und D10, D126, E2 und F60 von nsp14 zeigten die negativsten Netto-IEs unter den vorhergesagten wichtigsten interagierenden Resten im nsp14-nsp10-Komplex. Die Wechselwirkungen zwischen D29 und Y69, S15 und F60, F19 und K200, E6 und V4 von nsp10 bzw. nsp14 waren die stabilisierendsten paarweisen IEs (Abb. S20). Alle diese Reste mit der stärksten stabilisierenden Rolle in PPIs wurden als die wichtigsten interagierenden Reste in den vorangegangenen Schritten vorhergesagt.

Es wurden Proteinkontaktnetzwerkanalysen (PCN) der SARS-CoV-2-Komplexe nsp16-nsp10 und nsp14-nsp10 durchgeführt, um die topologische Bedeutung jedes Rests als Knoten im Protein-Protein-Netzwerk zu bestimmen. Die Knotenzentralitätsparameter der Reste, einschließlich der Gradzentralität (DC), der Zwischenzentralität (BC) und der Nähezentralität (CC) der Reste im Netzwerk, wurden für beide Komplexe vorhergesagt (Tabelle S5). Im nsp16-nsp10-Komplex zeigten G69, G70, Y96, A71 und K95 von nsp10 sowie V44, A45, V84 und D106 von nsp16 den höchsten DC unter den vorhergesagten Schlüsselresten. Die Ergebnisse zeigten, dass G69, M44, G70, G94 und K95 von nsp10 sowie V44, D106, D108, T91 und I40 von nsp16 den höchsten BC unter den kritischen PPI-Resten aufwiesen. Hohe CC-Werte der Schlüsselreste wurden für M44, G69, V57, K43 und G94 von nsp10 sowie V44, D106, V84 und A107 von nsp16 vorhergesagt (Abb. S21). Die PCN-Analyse der vorhergesagten wichtigsten interagierenden Reste der nsp14-nsp10-Wechselwirkung zeigte, dass unter den kritischen interagierenden Resten G70, Y96, A71, K95 und A20 von nsp10 sowie K9, D10, I55 und T131 von nsp14 einen hohen DC aufwiesen. Bemerkenswerterweise wurde auch für G70, A71, K95 und Y96 ein hoher DC im nsp16-nsp10-Komplex vorhergesagt, was darauf hindeutet, dass diese Netzwerke in beiden Komplexen gemeinsam waren. Darüber hinaus zeigten F19, S15, A20, A18 und V21 von nsp10 sowie G59, F60 und Y69 von nsp14 den höchsten CC unter den Schlüsselresten. Hohe BC-Werte der Schlüsselreste wurden für T5, A18, C79, A20 und F19 von nsp10 sowie G6, T25, G59, Y69 und F60 von nsp14 vorhergesagt (Abb. S22). Die 3D-Netzwerke der Komplexe nsp16-nsp10 und nsp14-nsp10 und ihre hervorgehobenen Schnittstellen sind in Abb. S23 dargestellt.

Um die Stabilität, Fluktuationen von Rückständen und das dynamische Verhalten von Proteinen zu untersuchen, wurden 100-ns-MD-Simulationen der Capping- und Proofreading-Komponenten von SARS-CoV-2 analysiert. Die RMSDs der Rückgrate als eines der Kriterien für die Strukturstabilität während der Simulationen wurden im Vergleich zur Referenzstruktur berechnet. Wie in Abb. 3a angedeutet, stiegen die RMSDs der Strukturen zunächst an, stiegen während der ersten 45 ns an und blieben dann stabil. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Konformationsänderungen geringfügig waren und die Bindung von nsp14 und nsp10 stabil war. Nsp14 hatte größere RMSD-Werte als nsp10, was darauf hindeutet, dass es in der freien Form flexibler war. Um die Schwankungen der Reste zu analysieren, wurden RMSFs der Cα-Atome berechnet. Höhere RMSF-Werte in nsp10 wurden hauptsächlich in der N-terminalen Schleife (A1-V7), der H1-Helix (S11-F19) und im Spulen- und Strangbereich (V42-T47) beobachtet (Abb. 3b). Höhere Schwankungen der H1-Helix in nsp10 können als Hinweis auf ihre Rolle bei der nsp14-ExoN-Aktivierung angesehen werden. In der nsp14-Struktur zeigten die Regionen, die die Wechselwirkungen mit nsp10 vermitteln, mehr Fluktuationen, die sich an der N-terminalen Domäne des Proteins befanden. MD-Simulationen zeigten, dass zwei bestimmte Domänen von nsp14 über eine Gelenkregion verbunden waren. Diese Gelenkregion kann die ExoN- und N7-MTas-Aktivität von nsp14 trennen. Die RMSDs des Rückgrats wurden in Bezug auf die Referenzstruktur für den nsp16-nsp10-Komplex sowie freie Formen der nsp16- und nsp10-Proteine ​​​​berechnet (Abb. 3a). Die RMSD-Werte waren nach 30 ns relativ stabil. Die durchschnittlichen RMSD-Werte für nsp16-nsp10, nsp16 und nsp10 betrugen 3,6, 2,4 bzw. 2,05 Å. Als nächstes wurden die RMSF-Werte für den nsp16-nsp10-Komplex, die nsp16- und die nsp10-Proteine ​​berechnet (Abb. 3b).

RMSD- und RMSF-Diagramme für die SARS-CoV-2-Komplexe nsp14-nsp10 und nsp16-nsp10 während 100 ns MD-Simulationen. (a) RMSD-Diagramm für nsp14-nsp10, nsp14, nsp10, nsp16-nsp10 und nsp16 und (b) RMSF-Diagramme für nsp10, nsp14, nsp14-nsp10, nsp16 und nsp16-nsp10.

Die Ergebnisse der PPI-Analyse schaffen einen geeigneten Kontext für das Arzneimitteldesign. Die Ergebnisse der oben genannten Analysen veranlassten uns, Peptidinhibitoren zu entwickeln, die auf die untersuchten Wechselwirkungen abzielen, um die Kappungs- und Korrekturlesemechanismen von SARS-CoV-2 zu stören. Zu diesem Zweck wurden in einem ersten Ansatz angesichts der vorhergesagten gemeinsamen Protein-Protein-Schnittstellen der nsp16-nsp10- und nsp14-nsp10-Wechselwirkungen (Abb. 2c) die inhibitorischen Peptide auf beide SARS-CoV-2-nsp16-2'O-MTasen abzielen und nsp14 ExoN wurden manuell entworfen. Eine Reihe von Dual-Target-Peptidinhibitoren (19 Peptide), im Folgenden als überlappende Peptide (OLPs) mit Längen im Bereich von 4 bis 8 bezeichnet (Tabelle S6), wurde auf der Grundlage der vorhergesagten überlappenden wichtigen interagierenden Reste von nsp10 in SAR-CoV entwickelt. 2, also T39-T47, G69-S72, C77-H80 und K93-Y96. In der Zwischenzeit wurden in einem parallelen Ansatz vier Sätze von Peptiden als heiße Segmente mit den signifikanten Bindungsenergien einzeln für jeden Komplex mithilfe des Peptiderive-Servers vorhergesagt. Insgesamt 22 lineare (P-16-5 bis P-16-15 und P-14-5 bis P-14-15) (Tabelle S7) und 16 zyklische Peptide (Tabelle S8) mit den höchsten relativen Schnittstellenwerten (Prozent). ) wurden designt. Es ist bemerkenswert, dass der Vergleich der mit den beiden Methoden entworfenen Peptide fünf ähnliche Peptidsequenzen ergab. Die OLPs, einschließlich OLP-11, OLP-13, OLP-16, OLP-18 und OLP-19, und die von Peptiderive entwickelten Peptide, die auf nsp16 abzielen, einschließlich P-16-5, P-16-6, P- 16-7, P-16-8 und P-16-9 haben die gleichen Sequenzen. Wichtig ist, dass in dieser Studie nur die linearen Peptide berücksichtigt und weiter bewertet wurden. Um die vorhergesagten zyklischen Peptide zu bewerten, ist eine weitere Forschungsstudie erforderlich.

Mittels molekularem Docking wurden die Bindungspositionen und -energien der entworfenen inhibitorischen Peptide an das Zielprotein untersucht. Der Andockvorgang umfasste zwei Schritte. Im ersten Schritt wurde das Peptid-Protein-Docking von HPEPDOCK mithilfe seines lokalen Docking-Algorithmus und durch Angabe der wichtigsten interagierenden Reste des Ziels durchgeführt. Basierend auf den besten Modellauswahlkriterien lagen die Docking-Energiewerte der 36 entworfenen Peptide zwischen –152,081 und –49,141 und zwischen –226,821 und –67,438 für das Andocken an nsp16 bzw. nsp14 (Tabellen S6 und S7). Unter den OLPs zeigten OLP-13, wenn das Ziel nsp16 war, und OLP-18, wenn das Ziel nsp14 war, die niedrigsten Andockenergiewerte (-148,518 bzw. -135,334). Die OLPs mit den niedrigsten Andockenergiewerten für beide Ziele wurden ausgewählt. Für den zweiten Schritt des Andockens wurden 14 von 36 entworfenen Peptiden mit den negativsten Andockenergiewerten verwendet, darunter OLP-13, OLP-16, OLP-17, OLP-18, P-16-11, P-16-12, P-16-13, P-16-14, P-16-15, P-14-11, P-14-12, P-14-13, P-14-14 und P-14-15 wurden ausgewählt .

Die Ergebnisse des Peptid-Protein-Andockens durch HADDOCK, einschließlich des HADDOCK-Scores, des RMSD der Gesamtstruktur mit der niedrigsten Energie, der Van-der-Waals-Energie, der elektrostatischen Energie, der Desolvatisierungsenergie und der vergrabenen Oberfläche für jeden Peptid-Zielkomplex, werden in berichtet Tabelle S9. Alle untersuchten Peptide interagierten mit nsp16 in fast denselben Positionen wie nsp10. Unter den OLPs-nsp16-Wechselwirkungen zeigten OLP-18 und OLP-13 die niedrigsten HADDOCK-Werte von −65,8 ± 4,6 und −50 ± 2,1 mit den großen vergrabenen Oberflächenbereichen von 1213,3 ± 29,8 bzw. 950 ± 16,9 Å2. P-16-11 und P-16-13 zeigten die negativsten HADDOCK-Werte unter den Peptiden, die speziell für die Ausrichtung auf nsp16 entwickelt wurden. Unter den OLPs-nsp14-Wechselwirkungen zeigten OLP-18 und OLP-13 die niedrigsten HADDOCK-Werte (−41,1 ± 1,9 bzw. − 39,1 ± 11,3). Der niedrigste HADDOCK-Score (− 99,4 ± 2,5) und die größte vergrabene Oberfläche (1918,3 ± 24,4 Å2) wurden für den P-14-15-nsp14-Komplex vorhergesagt. Die HADDOCK-Scores des Andockens von nsp10 an nsp16 und nsp14 wurden als Referenz vorhergesagt (−117,1 ± 2 bzw. -123,4 ± 3).

Im nächsten Schritt wurden ΔG und Kd des besten Peptid-Zielkomplexmodells für jedes Peptid berechnet (Tabelle S9). Das ΔG jedes Komplexes wurde mit dem ΔG der Referenzstruktur verglichen. Die vorhergesagten ΔG- und Kd-Werte für SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 betrugen − 12,8 kcal/mol bzw. 4,3 × 10−10 M. Unter den Peptiden, die auf nsp16 abzielen, zeigten P-16-15, P-16-14, P-16-12, OLP-18 bzw. P-16-13 die niedrigsten ΔG-Werte (die negativsten). beste Affinität). Die vorhergesagten ΔG- und Kd-Werte für nsp14 betrugen − 21,6 kcal/mol bzw. 1,4 × 10−16 M. Die Peptide, die auf nsp14 abzielen, also P-14-15, P-14-14, P-14-13, P-14-12 und P-14-11, zeigten die negativsten ΔG-Werte. Die ΔG-Werte von OLP-13 und OLP-18 für Wechselwirkungen mit nsp14 waren gleich (-8,9 kcal/mol). Die entworfenen Peptide mit niedrigeren Kd-Werten hatten das Potenzial, stärker an ihr jeweiliges Proteinziel zu binden. Darüber hinaus zeigt Tabelle S9 die Ergebnisse der MM-GBSA-Analyse der freien Energiezersetzung der Peptid-Zielkomplexe. Inhibitorische Peptide von nsp16, einschließlich OLP-18, P-16-12 und P-16-13, sowie Peptidinhibitoren von nsp14, einschließlich P-14-15, P-14-14 und P-14-12 , zeigten jeweils die negativsten freien MM-GBSA-Energien. Der Energiebeitrag der entworfenen Peptide pro Rest ist in Tabelle S9 aufgeführt. Die niedrigere Bindungsenergie eines Rests weist auf seine entscheidende Rolle bei der Peptid-Ziel-Wechselwirkung hin. In OLP-13-nsp16, OLP-13-nsp14, OLP-18-nsp16 und OLP-16-nsp14 zeigte Methionin an Position 5 im Vergleich zu anderen Resten der Peptide die niedrigste Energie. Außerdem sind die Top-10-Reste der Zielproteine ​​mit den niedrigsten Energien in Tabelle S9 aufgeführt, und die Top-5-Reste sind in den Abbildungen dargestellt. S24–S27. Bei OLPs-nsp16-Wechselwirkungen waren I40, M247, V44 und A83 die gemeinsamen Reste von nsp16 mit den niedrigsten Energiebeiträgen und daher wichtigeren Rollen. T25, P24 und F8 von nsp14 waren gemeinsame kritische Reste (mit den niedrigsten Energien) in allen OLPs-nsp14-Wechselwirkungen (Tabelle S9). Tabelle 2 fasst die entworfenen inhibitorischen Peptide, ihre vorhergesagten Docking-Scores und Bindungsenergien zusammen.

Im Anschluss an die Docking- und Bindungsenergieanalysen der entworfenen Peptide wurden die Wechselwirkungen der entworfenen Peptide in Tabelle 2 mit dem Zielprotein analysiert, um bessere Einblicke in die wichtigsten interagierenden Reste und ihre Interaktionstypen zu gewinnen. Die Reste des Zielproteins an der Schnittstelle, die an jeder Peptid-Ziel-Wechselwirkung beteiligt sind, sind in Tabelle S9 aufgeführt. Die Reste von nsp16, einschließlich I40, M41, V44, T48, V78, A79, P80, A83, V84, Q87, V104, S105, D106, L244 und M247, waren gemeinsame Reste, die an allen OLPs-nsp16-Wechselwirkungen beteiligt waren . Für P-16-11, P-16-12, P-16-13, P-16-14 und P-16-15, K38, G39, I40, V44, G77, V78, A79, A83, V84, Q87, V104, S105, D106, L244 und M247 von nsp16 waren häufige Reste an den Schnittstellen von Peptid-nsp16-Komplexen. Die gemeinsamen interagierenden Reste von nsp14 in allen OLPs-nsp14-Wechselwirkungen waren F8, A23, Q22, P24, T25, D126, T127 und T131. Auch V4, L7, F8, P20, T21, A23, P24, T25, H26, C39, V40, D41, F60, K61, M62, N63, Y64 und I201 von nsp14 waren häufig für die Vermittlung der Wechselwirkungen von P-14 verantwortlich -11, P-14-12, P14-13, P14-14 und P-14-15 mit nsp14.

Die Karten der Wechselwirkungen für OLP-13 und OLP-18 mit ihren Zielen (nsp16 und nsp14) zeigten, dass die hydrophoben Wechselwirkungen die häufigsten Wechselwirkungen in diesen OLP-Zielkomplexen waren (Abb. 4). Das N1 von OLP-13 war an drei H-Brücken mit A79, D106 und V104 von nsp16 beteiligt. Darüber hinaus bildete M5 von OLP-13 eine H-Bindung mit Q87 von nsp16. N1 von OLP-13 bildete zwei H-Brücken mit T5 und N3 von nsp14. Außerdem war C2 von OLP-13 an zwei H-Brücken mit G6 und L7 von nsp14 beteiligt. Weitere H-Brücken wurden zwischen K4 und L6 von OLP-13 bzw. T25 und D126 von nsp14 gefunden (Abb. 4a). Das N1 von OLP-18 bildete drei H-Brücken mit A79, G77 und V104 von nsp16. C2 und K4 von OLP-18 waren an H-Brücken mit D106 von nsp16 beteiligt. K4, M5, C7 und T8 von OLP-18 bildeten H-Brücken mit A83, Q87, L244 bzw. K38 von nsp16. Bei der OLP-18-nsp14-Wechselwirkung bildete K4 zwei H-Bindungen mit D126 und P24 von nsp14. T8 und C2 waren als Donoren an den H-Brücken mit K61 bzw. P20 von nsp14 beteiligt (Abb. 4b). Die Karten der Wechselwirkungen für die anderen Peptide sind in den Abbildungen dargestellt. S28–S31. Die hydrophoben Wechselwirkungen waren in diesen Peptid-Protein-Komplexen vorherrschend. Darüber hinaus sind die Schwankungen der Reste in jedem Zielprotein-Peptid-Komplex während der Simulationen in Abb. S32 dargestellt.

Die Karten der Peptid-Protein-Wechselwirkungen für die OLP-13- und OLP-18-Peptide und ihre Ziele (nsp16 und nsp14). (a) Peptid-Protein-Wechselwirkungen von OLP-13 mit nsp16 (links) und nsp14 (rechts) als Zielproteinen. (b) Peptid-Protein-Wechselwirkungen von OLP-18 mit nsp16 (links) und nsp14 (rechts) als Zielproteinen. Die schwarzen gestrichelten Linien und die braunen Bögen mit Speichen stellen die Wasserstoffbrückenbindungen bzw. die hydrophoben Kontakte dar.

Unter den entworfenen Peptiden wurden OLP-13, OLP-18, P-16-11, P-16-13, P-14-14 und P-14-15 mit den negativsten HADDOCK-Scores für die weitere Analyse ausgewählt. (Abb. 5). Diese am besten bewerteten Peptide wurden nach 50-ns-MD-Simulationen mit der MM-PBSA-Methode einer weiteren Bewertung unterzogen, um die freien Bindungsenergien zu untersuchen und die vielversprechendsten Peptide auszuwählen. Die MM-PBSA-Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Die negativen Werte der ΔG-Bindung von MM-PBSA für alle analysierten Peptide zeigten deren günstige Bindungsaffinitäten an das/die jeweilige(n) Ziel(e) an. P-16-11 und P-14-14 zeigten die niedrigsten ΔG-Bindungswerte für nsp16 und nsp14 (−30,4218 bzw. −33,6353 kcal/mol). Sowohl OLP-13 als auch OLP-18 zeigten eine bessere Bindungsaffinität mit einer günstigeren ΔG-Bindung an nsp16 (– 22,4568 und – 24,1671 kcal/mol) als an nsp14 (– 17,3694 und – 19,6176 kcal/mol).

3D-Strukturdarstellungen der am besten bewerteten Peptide für die Zielproteine ​​(nsp16 und nsp14). Die wichtigsten interagierenden Reste und Peptide sind rot bzw. türkis gefärbt.

Nach den beiden Schritten des molekularen Andockens und der anschließenden Analyse der freien Bindungsenergie durch MM-PBSA wurden die sechs Peptide mit der besten Bewertung (Abb. 5) als Leitpeptidsequenzen für eine umfassende In-silico-Sättigungsmutageneseanalyse ausgewählt, um die Peptide mit verbesserten Bindungsaffinitäten zu identifizieren Untersuchung der Auswirkungen jeder Mutation auf die entworfene Peptid-Ziel-Bindungsaffinität. In diesem Zusammenhang wurde eine große Bibliothek von Peptidinhibitoren mit 1539 neuen Peptidsequenzen generiert, indem jeder Rest von sechs Leitsequenzen zu den anderen 19 Aminosäuren mutiert wurde (Tabelle S10). Die positive ΔΔGAffinität der Mutante im Vergleich zum Wildtyp deutete auf einen verbesserten Einfluss dieser Mutation auf die Peptid-Ziel-Affinität hin. Für OLP-13 und OLP-18 zeigten 17,5 % bzw. 34,8 % der Substitutionen eine positive ΔΔGA-Affinität mit jeweils verbesserten Auswirkungen auf Peptid-nsp16-Wechselwirkungen. Allerdings zeigten nur 0,06 % und 0,07 % eine beträchtliche ΔΔGA-Affinität (> 0,5 kcal/mol). Bei OLP-13-nsp14- und OLP-18-nsp14-Wechselwirkungen zeigten 15 % bzw. 40 % der Mutationen verbessernde Auswirkungen mit positiver ΔΔGAffinität. Die Mutation der Peptidreste zu Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin zeigte die stärksten verbessernden Auswirkungen dieser Variationen auf die Peptid-Ziel-Affinität mit der positivsten ΔΔGA-Affinität (blaue Farbe). Allerdings verringerten diese Aminosäuren die vorhergesagte Bindungsaffinität an einigen Positionen, wie z. B. Substitutionen an N1, K4 und M5 von OLP-13 oder K4 und M5 von OLP-18 bei der Wechselwirkung mit nsp16 (Abb. 6a). Die Mutation von C2 und K4 von OLP-13 im Komplex mit nsp14 zu allen anderen 19 Aminosäuren führte zu einer negativen ΔΔGA-Affinität (rote Farben) mit abnehmenden Auswirkungen, was die entscheidende Rolle dieser Reste bei der OLP-13-nsp14-Wechselwirkung zeigt (Abb. 6b). ). Wärmekarten, die die In-silico-Sättigungsmutagenese anderer Leitpeptide darstellen, sind in Abb. S33 dargestellt. Um die optimierten Hemmpeptide zu erhalten, wurden außerdem die physikalisch-chemischen, pharmakokinetischen und toxischen Eigenschaften der entwickelten Peptide vorhergesagt. Diese Eigenschaften sind in Tabelle S11 detailliert aufgeführt. Die Allergenitätsvorhersage klassifizierte die entworfenen Peptide als wahrscheinliche Allergene und wahrscheinliche Nichtallergene. Darüber hinaus wurden in der Toxizitätsanalyse alle entwickelten Peptide mit Ausnahme von P-16-11, P-16-12 und P-16-13 als ungiftig eingestuft.

Wärmekarten, die eine In-silico-Sättigungsmutageneseanalyse von OLP-13- und OLP-18-inhibitorischen Peptiden darstellen. (a) OLP-13-nsp16- und OLP-18-nsp16-Wechselwirkungen und (b) OLP-13-nsp14- und OLP-18-nsp14-Wechselwirkungen. Mutationen mit verbessernden (positive ΔΔGAffinität) und abnehmenden (negative ΔΔGAffinität) Auswirkungen auf die Peptid-Ziel-Bindungsaffinität sind in Blau bzw. Rot dargestellt.

Um die Pan-Coronavirus-Peptidinhibitoren zu identifizieren, wurde die Konservierung der Zielreste, bei denen festgestellt wurde, dass sie mit den entwickelten Peptiden interagieren, bei CoVs analysiert. Eine multiple Sequenz-Alignment-Analyse des nsp16 aus sieben menschlichen CoVs, nämlich SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-229E (Abb. S34a), ergab dies Die Reste von nsp16, einschließlich G39, A79, P80, V84, V104, S105 und D106, die mit Peptiden interagieren, waren in diesen CoVs identisch. I40, M41, T48, G77, V78, A83, Q87, L244 und M247 von nsp16 waren ähnliche Reste. I40 wurde sowohl in HCoV-OC43 als auch in HCoV-HKU1 nsp16 durch Cystein und in MERS-CoV nsp16 durch Valin ersetzt. In nsp16 von MERS-CoV wurden M41, T48, V78 und M247 durch Histidin, Methionin, Isoleucin bzw. Leucin ersetzt. In HCoV-HKU1 wurde G77 durch Glutaminsäure ersetzt. A83 wurde bei MERS-CoV durch Serin und bei HCoV-NL63 durch Threonin ersetzt. In nsp16 von HCoV-NL63 und HCoV-229E wurden L244 und M247 durch Valin bzw. Leucin ersetzt. Als nächstes wurde die Konservierung des nsp16-nsp10-Komplexes bei vier CoVs (SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV und HCoV-OC43) analysiert (Tabelle S12). G39, T48, V84, S105 und D106 von nsp16 waren die am höchsten konservierten Reste mit einem Konservierungswert von 9 (dunkles Magenta). Andere wichtige Reste von nsp16, einschließlich I40, M41, V44, G77, V78, A79, P80, Q87, V104 und L244, waren mit Konservierungswerten von 6–8 (rosa) gut konserviert. Unter den untersuchten Rückständen war K38 ein sehr variabler Rückstand mit einem Wert von 1 (türkis). A83 und M247 von nsp16 waren mittelkonserviert oder variabel (von weiß bis türkis) (Abb. S34b). Eine multiple Sequenz-Alignment-Analyse von nsp14 unter den sieben CoVs zeigte, dass L7, F8, P20, A23, V40 und F60 von nsp14 identische Reste waren. V4, Q22, P24, T25, C39, D41, K61, M62, N63, T127 und I201 von nsp14 waren ähnliche Reste (Abb. S35a). L7, P20, A23, T25 und F60 waren die hochkonservierten Reste mit einem Wert von 9 im nsp14. F8, C39, V40, D41, K61, M62, N63 und T127 waren gut konserviert (mit Werten von 6–8). V4, Q22, P24, H26, Y64, D126, T131, I201, D41 von nsp14 waren variable Reste. T21 war ein Zwischenrest (mit einem Wert von 5) (Abb. S35b; Tabelle S12). Außerdem sind die Ergebnisse der Konservierungsanalyse für das nsp10-Protein in allen CoVs in Abb. S36 und Tabelle S12 dargestellt.

In dieser Studie haben wir die PPIs in RTC untersucht und uns dabei insbesondere auf die Rollen von nsp14 und nsp16 und ihren gemeinsamen kritischen Cofaktor nsp10 konzentriert. Interaktionen von nsp10 sowohl mit nsp14 als auch mit nsp16 zeigten seine zentrale aktivierende Rolle beim Überleben und der Pathogenese von CoVs (Abb. 1a). Die Ausrichtung auf diese beiden PPIs ist in mehrfacher Hinsicht wichtig. Die Größe des Genoms von CoVs rechtfertigt die Notwendigkeit einer ExoN-Aktivität. Die Fähigkeit von RdRp, Nukleotide korrekt auszuwählen, reicht nicht aus, um Replikationstreue zu gewährleisten, was die Bedeutung der Korrekturleseaktivität von nsp14 ExoN bestätigt74. Die Interaktion von nsp14 mit nsp10 verstärkt seine ExoN-Aktivität in vitro um das bis zu 35-fache75. Darüber hinaus kann eine Beeinträchtigung des letzten Schritts des Capping-Prozesses bei SARS-CoV-2 (Abb. 1b) die Replikation, Translation und virale Fluchtmechanismen blockieren. Studien haben die Hemmung der enzymatischen Aktivität von nsp16 in CoVs durch Peptide gezeigt, die vom nsp10 von SARS-CoV26 und dem Maus-Hepatitis-Virus (MHV)27 abgeleitet sind.

Um die Peptidinhibitoren am Ausgangspunkt des Arbeitsablaufs zu entwerfen (Abb. S3), wurden die Schlüsselreste vorhergesagt, die die Wechselwirkungen von nsp10 mit nsp14 ExoN und nsp16 2'-O-MTase vermitteln (Abb. 2 und Tabelle 1). Alle wichtigen interagierenden Reste von nsp14 wurden in Richtung seiner ExoN-N-terminalen Domäne verteilt. Dies weist darauf hin, dass nsp10 möglicherweise nicht an der Aktivierung der N7-MTase beteiligt ist und möglicherweise auch die unterschiedlichen Rollen der nsp14-Domänen offenlegt. Diese Ergebnisse stimmten mit den Studien überein, die die unabhängige Funktion von nsp14 ExoN und N7-MTase durch die Hydrolyseanalyse76 sowie die biochemische Analyse77 zeigten. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der MD-Simulationen, dass eine Gelenkregion die beiden Domänen von nsp14 trennte. Darüber hinaus spiegelt die höhere Flexibilität dieser Regionen möglicherweise ihre Rolle bei der Vermittlung von PPIs wider. Aufgrund der dynamischen Natur der Schleife zeigten die Schleifen sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus von nsp10 im Vergleich zu anderen Resten eine größere Flexibilität. Wichtig ist, dass der Vergleich der wichtigsten interagierenden Reste in diesen beiden PPIs darauf hindeutet, dass 24 Reste in nsp10 sowohl mit nsp16 als auch mit nsp14 in SARS-CoV-2 interagierten (Abb. 2c). Mutagenese- und BRET-Analysen wurden auch verwendet, um nsp10-überlappende Wechselwirkungen in SARS-CoV78 abzubilden. Das einzigartige Merkmal dieser überlappenden wichtigen interagierenden Reste dient als Fenster für die gezielte Bekämpfung zweier Schlüsselproteine ​​(nsp16 und nsp14) mit einem Inhibitor (OLP). Bouvet et al.78 zeigten, dass K43A- und Y96F-Mutationen in nsp10, die als „Mutator-Phänotyp“ bezeichnet werden, bei SARS-CoV-Mutationen zunehmen. Darüber hinaus verringerten sich nsp10-Mutationen oder beendeten die ExoN-Aktivierung75. Die Ergebnisse der CAS-Analyse (Abb. S9) stimmen mit diesen Berichten überein. Studien haben gezeigt, dass die Inaktivierung von nsp14-ExoN in CoVs die Replikationstreue um das bis zu 20-fache verringert und das Fehlen von ExoN-Aktivität die Empfindlichkeit gegenüber tödlicher Mutagenese in Gegenwart von RNA-Mutagenese verbessert hat79. Die Erklärung der Ähnlichkeiten und Unterschiede der Grenzflächen- und Hotspot-Reste zwischen SARS-CoV-2 und anderen CoVs (Abb. S6–S8) wird zur zukünftigen Vorbereitung auf mögliche neu auftretende CoVs beitragen. Darüber hinaus ist diese Studie die erste, die die wichtigsten interagierenden Reste (Abb. S8) und ihre Karte der Wechselwirkungen (Abb. S17) vorhersagte und außerdem die Konservierungsanalyse (Tabelle S12) für die kürzlich berichtete Struktur von HCoV-OC43 durchführte nsp16-nsp10 complex33.

Die großen Grenzflächen wurden bei der Bildung der Komplexe nsp14-nsp10 und nsp16-nap10 vergraben. Daher zeigten diese großen Schnittstellenbereiche mit einer großen Anzahl wichtiger interagierender Reste, dass diese PPIs durch störende Peptide statt durch kleine Moleküle gezielt angegriffen werden. Kleine Moleküle stehen vor der Herausforderung, in diesen großen Bereichen mit der Interaktion des ursprünglichen Partners (nsp10) zu konkurrieren. Darüber hinaus zeigten Karten der Restwechselwirkungen die komplizierten Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophoben Wechselwirkungen (Abb. S14), was darauf hindeutet, dass die gezielte Steuerung dieser hydrophoben Wechselwirkungen mit kleinen Molekülen möglicherweise schwieriger und sogar unwahrscheinlich ist. Andererseits kann die geringere Größe der entworfenen Peptide im Vergleich zu nsp10 einen Vorteil bei der kompetitiven Bindung bieten, da die Konzentration an der Schnittstelle effektiv höher ist und sich folglich ihre Affinität verbessert.

Basierend auf den Ergebnissen der PPI-Analyse wurden die Peptidinhibitoren anschließend rechnerisch so konzipiert, dass sie auf die RNA-Capping- und Korrekturlesemechanismen in SARS-CoV-2 abzielen (Tabellen S6–S8). Anschließend wurden die entworfenen Peptide bewertet (Tabelle S9). Unter den OLPs zeigten OLP-18 (NCVKMLCT) und OLP-13 (NCVKML) die niedrigsten Docking-Scores und Bindungsenergien, beteiligten sich an einer großen Anzahl kritischer Zielreste an den Wechselwirkungen, zeigten die richtigen Bindungspositionen und akzeptable Eigenschaften. Peptid-Protein-Wechselwirkungen waren überwiegend hydrophob (Abb. 4), ähnlich den nativen Wechselwirkungen (Abb. S14). Es gab keine allgemeine Korrelation zwischen der Peptidlänge und der freien Bindungsenergie für die entworfenen Peptide, wenn nsp16 das Zielprotein war. Allerdings zeigten die freien Bindungsenergien der Peptide, wenn nsp14 das Ziel war, eine direkte Korrelation mit der Peptidlänge (Tabelle 2). Darüber hinaus waren die HADDOCK-Scores aller analysierten Peptide höher als die der nativen Interaktionen. Um die Peptide zu identifizieren, die stärker mit nahezu oder niedrigerer ΔG-Bindung binden als der native Partner (nsp10), wurden die entworfenen Peptide durch In-silico-Sättigungsmutageneseanalyse optimiert und eine neue Peptidbibliothek generiert (Tabelle S10). Mithilfe dieser rechnerischen Mutationsanalyse wurden die Substitutionen mit der positivsten ΔΔGAffinität ermittelt (Abb. 6 und S33). Diese Mutanten, die in die engere Auswahl kamen, starten eine neue Runde komplementärer Computerstudien, indem sie die in dieser Studie beschriebenen Methoden zur Bewertung der neu entwickelten Peptide einsetzen. Darüber hinaus ergab die Konservierungsanalyse die Konservierung der Zielreste, die mit den entworfenen Peptiden interagierten (Abb. S34 und S35; Tabelle S12). Aufgrund der konservierten Natur der Zielreste haben die entwickelten Peptide daher das Potenzial, als Pan-Coronavirus-Inhibitoren zu fungieren und könnten für mögliche neu aufgetretene CoVs nützlich sein. Darüber hinaus sind die in dieser Studie beschriebenen zyklischen Peptide einer weiteren rechnerischen Untersuchung wert.

S-Adenosyl-l-Homocystein als Nebenprodukt der MTase-Reaktion, Sinefungin und Aurintricarbonsäure (ATA) wurden als nsp16-Substratbindungsinhibitoren von CoVs identifiziert. SAM wird von verschiedenen zellulären MTasen des Wirts als Methyldonor verwendet. Die Inhibitoren der SAM-Bindungsstelle wirken sich auf die 2'-O-MTase-Aktivität des Wirts aus und führen zu induzierten zytotoxischen Wirkungen80. In dieser Studie wurde auf die einzigartige virale Interaktionsstelle abgezielt. Daher sind die entwickelten Peptide möglicherweise selektiver und leistungsfähiger als SAM-Mimetika. Nach unserem besten Wissen ist derzeit kein nsp14-Peptidinhibitor für CoVs verfügbar, und diese Studie stellt den ersten rechnerischen Aufwand dar. Das Herausschneiden von Ribavirin-5'-Monophosphat als Guanosin-Analogon aus RNA-Substraten durch den nsp14-nsp10-Komplex erklärt seine geringe Aktivität gegen CoVs. Im Mutator-Phänotyp von nsp14 mit ExoN-Inaktivierung zeigte Ribavirin eine 20081 und Remdesivir eine 4,5-fach erhöhte Empfindlichkeit82. Neben diesen Studien wird hier die Kombinationstherapie von Nukleosidanaloga (NAs) mit dieser ersten Generation von NSP14-Peptidinhibitoren vorgeschlagen (Abb. 7). Ungeachtet der Peptideinschränkungen lohnt es sich, diese vorgeschlagene Strategie zu erkunden. Darüber hinaus wird erwartet, dass die vorgeschlagene Therapie die antiviralen Wirkungen von NAs ergänzt und möglicherweise eine Hemmung sowohl der RNA-Replikations- als auch der RNA-Korrekturlesemechanismen auslöst. Darüber hinaus wird angenommen, dass die entwickelten Peptide, wenn sich infolge von RdRp-Mutationen eine Remdesivir-Resistenz entwickelt, wahrscheinlich die Wirksamkeit von Remdesivir steigern könnten, ohne das Risiko einer Resistenz zu erhöhen83. Einige wichtige Aspekte der molekularen und biochemischen Gesichtspunkte sind jedoch noch unbekannt, und die entwickelten Peptide erfordern weitere rechnerische und experimentelle Studien. Weitere Forschung ist erforderlich, um die Aktivitäten der vorgeschlagenen Peptide in vitro und in vivo zu untersuchen und ihre Spezifität, Wirksamkeit und Pharmakokinetik zu bewerten. Darüber hinaus wird bei der Betrachtung der entwickelten Peptide als potenzielle Therapeutika für COVID-19-Patienten empfohlen, ihr Verabreichungssystem zu untersuchen, insbesondere die bevorzugten Verabreichungsstrategien, wie z. B. subkutan oder intravenös, ähnlich den kürzlich von der FDA zugelassenen Peptiden84. Um die Immunität des Wirts zu umgehen, könnten die Peptide auch bei COVID-19-Patienten mithilfe von in vitro transkribierter (IVT) mRNA85 erzeugt werden.

Schematische Darstellung der vorgeschlagenen Strategie für die Kombinationstherapie von Nukleosidanaloga (NAs) mit den von nsp14 ExoN entwickelten Peptidinhibitoren. Die in dieser Studie entwickelte Kombinationstherapie von Ribavirin, Remdesivir oder anderen NAs mit den nsp14-ExoN-Peptidinhibitoren soll die antiviralen Wirkungen der NAs vervollständigen und sowohl die RNA-Replikation als auch die RNA-Korrekturlesemechanismen blockieren.

CoVs sind seit vielen Jahren die Ursache menschlicher Atemwegssyndrome. Die globale COVID-19-Pandemie hat in den letzten Jahren zu zahlreichen gesundheitlichen und wirtschaftlichen Komplikationen geführt. Dies unterstreicht die Bedeutung der Untersuchung der strukturellen und molekularen Grundlagen von SARS-CoV-2 mit hoher Infektionsrate für die Entwicklung von Impfstoffen und Therapeutika. Neben der Rezeptorerkennung führt die Untersuchung jedes einzelnen Punkts des RTC und insbesondere der PPIs von NSPs zur Entwicklung spezifischer interferierender antiviraler Medikamente, wie Peptidinhibitoren, mit dem Potenzial, auf eine einzigartige virale Interaktionsstelle abzuzielen. Die Überlappung der Protein-Protein-Schnittstellen zwischen nsp16-nsp10 mit Capping-Aktivität und nsp14-nsp10 als Wächter der Replikation mit Korrekturleseaktivität macht diese PPIs zu vielversprechenden Zielen für die Entwicklung antiviraler Medikamente für CoVs. Eine Störung des SARS-CoV-2-Cap-1-Bildungsschritts kann die 2′-O-MTase-Aktivität stören und möglicherweise die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass virale mRNAs von wichtigen Proteinsensoren beeinflusst werden, um die frühesten Immunreaktionen gegen die Virusinfektion auszulösen. Zelluläre Sensoren wie Toll-like-Rezeptoren (TLR), Retinsäure-induzierbares Gen I (RIG-I) und Melanomdifferenzierungs-assoziiertes Protein 5 (MDA5) erkennen RNAs, denen 2′O-Methyl am ersten Nukleotid fehlt, und induzieren eine Signalübertragung Kaskaden, die zur Expression und Freisetzung von Zytokinen und Typ-I-Interferon führen16. Diese Studie liefert umfassende Informationen über die Schlüsselreste, die die Wechselwirkungen von nsp10 als dualer Cofaktor mit nsp16 2′O-MTase und nsp14 ExoN im SARS-CoV-2 und anderen CoVs vermitteln und die für die Entwicklung neuer Therapeutika zur Bekämpfung aktueller oder nützlicher sind zukünftige CoVs. Die PPI-Ergebnisse zeigten, dass 24 interagierende Reste an den PPI-Schnittstellen dieser Komplexe häufig vorkommen. Daher wurden OLPs mit dualer Hemmwirkung entworfen, bewertet und anschließend optimiert. Die vorhergesagte Konservierung der Zielschlüsselreste bietet eine neue Richtung für die Entwicklung von Pan-Coronavirus-Inhibitoren. Die Bemühungen, die Peptide aus der aktuellen Studie erfolgreich zu entwickeln und zu optimieren, könnten sie zu einer neuen Generation antiviraler Kandidaten für die Behandlung von COVID-19 oder künftigen damit verbundenen Ausbrüchen machen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Abteilung für Zell- und Molekularbiologie und Mikrobiologie, Fakultät für Biowissenschaften und Technologie, Universität Isfahan, Isfahan, Iran

Fatemeh Arabi-Jeshvaghani, Fatemeh Javadi-Zarnaghi und Mohamad Reza Ganjalikhany

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FA, FJ und MRG haben die Studie entworfen. FA hat die Daten gesammelt. FA, FJ und MRG analysierten und diskutierten die Ergebnisse. FA hat das Manuskript geschrieben. FJ und MRG überprüften und überarbeiteten das Manuskript.

Korrespondenz mit Fatemeh Javadi-Zarnaghi oder Mohamad Reza Ganjalikhany.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Arabi-Jeshvaghani, F., Javadi-Zarnaghi, F. & Ganjalikhany, MR Analyse kritischer Protein-Protein-Wechselwirkungen des SARS-CoV-2-Cappings und Korrekturlesen molekularer Maschinen zur Entwicklung dualer Target-Hemmpeptide. Sci Rep 13, 350 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26778-8

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Eingegangen: 07. August 2022

Angenommen: 20. Dezember 2022

Veröffentlicht: 07. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26778-8

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